A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋简短
剧中：目前为止正肆虐全球的新型冠状小儿原小儿 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家所和地区大广为流传，截至 2021 年 4 同年已避免微过 1.28 亿人染小儿，微过 280 都来遇害。也就是说，尚待可必要提高 COVID-19 感染率的外科手忍术分析方法。我们科学研究了一种传统意义的之中医抗生素药剂——欲求肺毒抗生素液 (RDS) 的潜在防冠状小儿原活持续性，该抗生素液主要成份为东方医学传统意义之中用做外科手忍术心脏疟疾的之中药材。
结果：RDS 选择持续性 SARS-CoV 太快小儿原、SARS-CoV-2 太快小儿原、混合成乙型小儿原-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型小儿原以及传染持续性 SARS-CoV-2 和独有的 Ha-CoV-2 桃花心木小儿原 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对外源膜的染小儿。我们必要持续性显然了 RDS 可以并不需要灭活 SARS-CoV-2 小儿原薄膜的传染持续性。此外，我们发掘成 RDS 还可受阻乙型亚型对外源膜的染小儿。
论点：RDS 可广为选择持续性颤动道小儿原染小儿。关键字：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状小儿原，防小儿原外科手忍术，欲求肺毒抗生素液，传统意义之中医，SARS-CoV，乙型猪流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型小儿原
▋剧中
目前为止正肆虐全球的新型冠状小儿原小儿 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家所和地区大广为流传，截至 2021 年 4 同年已避免微过 1.28 亿人染小儿，微过 280 都来遇害。也就是说，尚待可必要提高 COVID-19 感染率的外科手忍术分析方法。新成现的 COVID-19 小儿原小儿原体为冠状小儿原 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急持续性颤动综合征涉及冠状小儿原一般而言之中的兄弟小儿原[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 刚开始都是在之欧美发掘成的；SARS-CoV 小儿原于 2002 年 11 同年在广东省首次被发掘成[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同年在武汉首次被发掘成[1,7,8]。在之欧美，这两次由冠状小儿原激起的疫情之中，之中医除此以外被广为用做，用以先行补救冠状小儿原激起的疟疾。对于也就是说的 COVID-19 大广为流传，之欧美有微过 85% 的 SARS-CoV-2 染小儿患者放弃了传统意义之医疗卫生麻醉药（9，10）。许多用做的之中医是否是有着必要的防冠状小儿原特持续性并在药理学上是否是必要，这个重要弊端即已赢取更好回应。
之中医作为外科手忍术冠状小儿原所随之而来疟疾的必要麻醉药，但由于欠缺体内或灌注的管理系统科学研究，其转型与合理用做除此以外受到了顾虑。为了明确之中医的潜在防 SARS-CoV-2 活持续性，我们从常用之中医之中筛选了多种药材人类碱，并从之中医抗生素液 RDS(宾夕法尼亚州一种赢利持续性食品摄入) 之中发掘成了防 SARS-CoV 和防 SARS-CoV-2 小儿原的活持续性，一种在宾夕法尼亚州的赢利食品摄入。RDS 用做加强人体颤动管理系统的相比之下肥胖症，其包则有多种药材成份，如当归和麦冬，它们是传统意义上用做支配发炎和心脏疟疾的之中药材 (11-13)。在此，我们路透社 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假小儿原以及有着染小儿持续性的野生型 SARS-CoV-2 小儿原对外源膜的染小儿有着糖皮质激以次。我们必要持续性显然 RDS 可通过并不需要灭活小儿原薄膜或阻扰小儿原侵入而选择持续性小儿原的一时期染小儿间隔时间表。此外，我们发掘成 RDS 还可以阻扰甲流小儿原对外源膜的染小儿。这些早先，RDS 对颤动道小儿原的染小儿确实有着广为的糖皮质激以次。
▋结果
为了从传统意义之中药材之中寻找潜在的防 SARS-CoV-2 活持续性，我们从共约四十种传统意义药材之中筛选浓缩成 SARS-CoV-2S 酶假型太快小儿原[14,15] 和人体心脏 A549(ACE2) 外源膜，此人类 ACE2 基因会通过太快小儿原转导作为表现形固定式介导，从而稳定转导来实现微强调。太快假型小儿原用做浅绿色荧光酶 (GFP) 或荧光以次酶 (Luc) 作为路透社基因，并通过了有着广谱防小儿原重回选择持续性剂，以及的兄弟阿维 (Arbidol)[16]，和人类防毒血清反防 SARS-CoV-2(布 1a、C) 的验证。我们并能成功验证到的兄弟阿维 (Arbidol) 和防毒血清对于 SARS-CoV-2 假型小儿原的糖皮质激以次，这是我们在其他四十余种传统意义药材人类碱检测之中不会发掘成的，包则有其之中一些共存较高致癌的药材 (布 1a-C)。然而，鉴于太快持续性假型小儿原至少能验证 SARS-CoV-2 小儿原的侵入不道德，我们不能无关这些药材人类碱确实有在重回后阶段并能选择持续性 SARS-CoV-2 的有确实。我们必要持续性从传统意义制剂欲求肺毒抗生素液 (RDS) 之中筛选成了确实的防 SARS-CoV-2 活持续性，该电子产品成份几类药材成份——、连翘、当归、麦冬、虎皮菀、苦杏仁、蜂房、皂角、冬瓜，在之欧美传统意义上用做外科手忍术心脏疟疾 (11-13)。
成份吡啶果汁乙酸、3，4-二邻果汁酰精油乙酸、吡啶 3，4-二邻果汁酰精油乙酸、原儿茶乙酸、吡啶绿原乙酸和瑞香草以次；花蕾之中还成份磷乙酸 A、B 和 10 种已知环乙烯醚萜磷乙酸[17]；该豆科植物还成份皂人类碱人类碱 A 和 B，以及防发炎起到的磷乙酸 C[18,19]。连翘酯磷乙酸之中成份木脂以次、松脂吡啶连翘磷乙酸[20]。当归之中成份被统称当归皂磷乙酸的甾体皂磷乙酸，是当归旧称豆科植物独有的豆科植物化学物质[21,22]。大花麦冬之中主要活持续性成份为四种单萜，(−)-茴香酮、(+)-普利莱格酮、(−)-柠檬乙烯和 (+)-茴香呋喃；这种豆科植物还成份其他氧化物，如 1-辛乙烯-3-醚、3-辛酮、β-同年桂乙烯和β-石竹乙烯[23]。虎皮菀成份微过 162 种氧化物，包则有环乙烯醚萜和环乙烯醚萜磷乙酸、苯丙磷乙酸、乙乙酸、人参、糖类、类物质、和皂磷乙酸[24]。苦杏仁之中成份类似物、氰基氧化物和糖分多糖[25]。皂角刺之中成份皂磷乙酸和羽扇豆乙酸[26,27]，而冬瓜之中成份主要活持续性成份冬瓜乙酸[28]。为了必要持续性检测 RDS 的防 SARS-CoV-2 活持续性，用相同溶解乙酸度的 RDS 预两处置 A549(ACE2) 细胞膜，然后让这些细胞膜在共存 RDS 的确实会下放弃 4-6 全程的染小儿。染小儿后，在不共存 RDS 的确实会下培育细胞膜，然后在 48 和 72 全程的时候，通过流固定式细胞膜忍术对小儿原染小儿的糖皮质激以次同步进行计量。为了支配细胞膜致癌，用做碲丙啶 (PI) 对刚遇害和已遇害的细胞膜同步进行染料，至少在活细胞膜群之中分析分析方法 GFP+细胞膜。如布 2 标明，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假小儿原有着副作用选择持续性糖皮质激以次。为了断定这些结果，我们用做内源持续性强调 ACE2 的 VeroE6 细胞膜移位了该染小儿科学研究。
(只见下页布)
ACE2 之下强调，采购持续性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 小儿原可对其同步进行染小儿，ACE2 通常用做冠状小儿原的科学研究 (7)。考虑到在欠缺 ACE2 微强调 [15，29，30] 的确实会下，假型小儿原对 VeroE6 的染小儿持续性较低，我们还用做了荧光以次酶路透社基因假型小儿原，该小儿原的路透社基因强调由 HIV-1LTR 和 Tat 涡轮机，有着更高的路透社基因敏感持续性和数据压缩。
布 2：RDS 选择持续性 SARS-CoV-2(GFP) 假型小儿原染小儿 A549(ACE2) 细胞膜。
A.A549(ACE2) 细胞膜用 RDS 紧接著溶解 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型小儿原染小儿。将细胞膜彩衣去小儿原和 RDS，并在不共存 RDS 的确实会下同步进行培育。流固定式细胞膜容验证小儿原染小儿选择持续性确实会。未染小儿的细胞膜和染小儿 SARS-CoV-2(GFP) 但未获 RDS 外科手忍术的细胞膜作为对照。GFP+细胞膜百分比已说明了。(PI) 碲丙啶。
B.RDS 的细胞膜致癌管理系统持续性。A549(ACE2) 细胞膜用 RDS 紧接著溶解 4 全程，彩衣去 RDS，无 RDS 培育 48 全程。碲丙啶染料核对即将遇害细胞膜和已遇害细胞膜，流固定式细胞膜忍术分析分析方法。以次描副作用-中间体细胞膜致癌曲率，RDS 的半被害乙酸度 (LC50) 比率为 1:11.9。
如布 3A 标明，我们用做 Luc 分析报告基因假小儿原和 VeroE6 细胞膜同步进行染小儿科学研究，捕捉到到 RDS 对该小儿原染小儿有着副作用选择持续性糖皮质激以次，并且九成选择持续性乙酸度明确为 1:230RDS 溶解度 (布 3B)。我们还计量了 RDS 对 VeroE6 细胞膜朝气的影响，明确了 50% 细胞膜遇害副作用为 1:11.8RDS 溶解度。
布 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假小儿原和野生型 SARS-CoV-2 小儿原的副作用选择持续性选择持续性糖皮质激以次。用 RDS 紧接著溶解预两处置 A、BVeroE6 细胞膜，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型小儿原染小儿。将细胞膜彩衣去小儿原和 RDS，并在不共存 RDS 的确实会下同步进行培育。在染小儿后 72 全程用荧光以次酶验证小儿原染小儿的糖皮质激以次。未染小儿细胞膜和 SARS-CoV-2-luc 染小儿但未获过 RDS 外科手忍术的细胞膜作为对照。科学研究移位三次。以次描副作用中间体曲率和 RDS 的 I-C50 溶解比率为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞膜的细胞膜致癌也通过碲丙啶染料和流固定式细胞膜忍术管理系统持续性。用 RDS 紧接著溶解 4 全程，彩衣去 RDS，在不则有 RDS 的确实会下培育 72 全程。以次描细胞膜致癌副作用-中间体曲率，RDS 的半被害乙酸度 (LC50) 比率为 1:13.8 溶解。DRDS 选择持续性传染持续性 SARS-CoV-2 染小儿。用紧接著溶解的 RDS 预两处置 VeroE6 细胞膜，并在 RDS 共存的确实会下染小儿 SARS-CoV-2。染小儿 48 全程后，通过凶菌斑分析分析方法小儿原释放后的小儿原遗传物质选择持续性确实会。选择持续性试验中一固定式三份同步进行，并在 Prism7(Graph Pad) 之中用做单向正态分布 (One-Way ANOVA) 分析分析方法及 Dunnett 后检查和 (Dunnett's Post Test)，为了将明确总和显着持续性。很大持续性绝对值用星号回应如下：*p
为了必要持续性验证用做假小儿原授予的结果，我们检测了 RDS 对于 SARS-CoV-2 染小儿的受阻传染持续性并能。如布 3D 标明，RDS 同时也受阻了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞膜的染小儿。RDS 在溶解 1:40 以上时可很大续加小儿原斑点的演化成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假小儿原与传染持续性小儿原的早先，RDS 成份选择持续性 SARS-CoV-2 染小儿的活持续性成份，确实是通过并不需要灭活小儿原或受阻小儿原的一时期染小儿间隔时间表。
为必要持续性科学研究确实的机制，我们将传染持续性 SARS-CoV-2 小儿原薄膜与紧接著溶解的 RDS 在 37°C 下预培育 1 全程。随后，将硫乙酸必要持续性依次溶解-(10–1 至 10–4)，并转到 Vero 细胞膜同步进行凶菌斑分析分析方法以明确小儿原染小儿持续性的提高。如布 4A 标明，我们捕捉到到在 RDS 之中短暂渗透到一全程后的小儿原薄膜，其 SARS-CoV-2 的染小儿效价也圆形副作用选择持续性下降。该结果断定了 RDS 可必要并不需要灭活 SARS-CoV-2 小儿原薄膜的传染持续性。
我们必要持续性检测了 RDS 是否是也能选择持续性 SARS-CoV-2 小儿原桃花心木的染小儿。为此，我们利用早先开发新的混合成甲小儿原-SARS-CoV-2 假型小儿原 (Ha-CoV-2)[31] 来提纯一新作 S 酶则有，包则有英国政府则有 (B.1.1.7)，纳米比亚则有 (B.1.351)，智利则有 (P.1)，加州则有 (B.1.429)，和其他几个新兴则有 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和涉及 S 酶突变体在 37°C 紧接著溶解 RDS 培育 1 全程。随后，用该硫乙酸染小儿 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 外源膜。染小儿后 12 全程，荧光以次酶定量小儿原染小儿的糖皮质激以次。如布 4B 标明，我们还捕捉到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶则有的副作用选择持续性选择持续性。
我们还检测了 RDS 受阻 SARS-CoV 染小儿的并能，用做含有 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 路透社基因太快小儿原和[15] 假副作用。我们将人 A549(ACE2) 细胞膜用作外源膜，将其用新作溶解的 RDS 预两处置，然后用 SARS-CoV(GFP) 分析报告基因假小儿原染小儿 4-6 全程。染小儿后在不则有 RDS 的确实会下培育细胞膜，流固定式细胞膜忍术计量验证其对小儿原染小儿的糖皮质激以次。除此以外，用做碲丙啶无关即将遇害与已遇害的细胞膜，至少在活细胞膜群之中分析分析方法 GFP+细胞膜。如布 5A 标明，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型小儿原的糖皮质激以次圆形副作用选择持续性。我们必要持续性断定了这些结果，并计量了 RDS 介导的选择持续性与 Luc 路透社基因 SARS-CoV 假型小儿原，SARSCoV(Luc)。我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的糖皮质激以次圆形副作用持续性依赖于，其半选择持续性乙酸度 (IC50) 为 1:70.88 溶解度 (布 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用做 ACE2 染小儿外源膜，我们还检测了 RDS 的防小儿原活持续性是否是至少针对与 ACE2 有相互起到的冠状小儿原。为此，我们验证了一种不涉及的负链 RNA 小儿原便是乙型亚型。它通过小儿原血凝以次 (HA) 和细胞膜α-唾液乙酸来染小儿外源膜。为了提纯乙型亚型，将强调乙型猪流感 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个相片的 8 个表现形固定式和一个 GFP-路透社基因共转染到 HEK293T 细胞膜之中。在 RDS 共存的确实会下，搜集小儿原薄膜并用做染小儿前提 MDCK 细胞膜。如布 6A 标明，我们捕捉到到 RDS 对乙型亚型的糖皮质激以次圆形副作用选择持续性。RDS 在 1:40 和 1:80 溶解时可完全受阻小儿原染小儿，在 1:160 溶解时则可大部分选择持续性乙型猪流感。RDS 对 MDCK 细胞膜的半被害乙酸度 (LC50) 经定量为 1:18.5(布 6B)。这些早先，RDS 的防小儿原活持续性并非针对特定小儿原，而确实并能广为选择持续性多种颤动道小儿原，如冠状小儿原和乙型亚型。
▋探讨
在本分析报告之中，我们显然了传统意义制剂欲求肺毒抗生素液 (RDS) 成份广谱防小儿原活持续性，可受阻 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型亚型的染小儿。虽然 RDS 并能选择持续性多种小儿原，但其防小儿原活持续性因小儿原类型和HIV-而异。例如，对 SARS-CoV 太快假小儿原的 I-C50 乙酸度为 1:7.9 溶解度，对 SARS-CoV-2 太快假小儿原的 I-C50 乙酸度为 1:230 溶解度。对于传染持续性野生型 SARS-CoV-2 小儿原，I-C50 为 1:40 溶解度，对乙型猪流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其桃花心木有相同的糖皮质激以次，IC50 数绝对值从 1:70 到 1:2601 溶解度共约数 (布 4B)。
(只见下一页布)
布 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和独有的 Ha-CoV-2 桃花心木有着副作用选择持续性灭活起到。ASARS-CoV-2 薄膜加紧接著溶解的 RDS 在 37°C 下培育 1 全程。随后，将硫乙酸必要持续性紧接著溶解，并转到 Vero 细胞膜之中同步进行凶菌斑分析分析方法，以明确小儿原染小儿持续性提高。选择持续性试验中一固定式三份同步进行，并在 Prism7(GraphPad) 之中用做单向正态分布 (One-WayANOVA) 分析分析方法和 Dunnett 后检查和 (Dunnett'sPostTest) 为了将明确总和显着持续性。很大持续性绝对值用星号回应如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和涉及 S 酶则有与紧接著溶解的 RDS 在 37°C 培育 1 全程后，用硫乙酸染小儿 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 外源膜。染小儿后 12 全程，荧光以次酶定量小儿原染小儿的糖皮质激以次。RDS 的 IC50 绝对值的溶解度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们必要持续性显然了 RDS 可以选择持续性冠状小儿原的一时期染小儿间隔时间表。虽然具体情况的防小儿原机制即已清楚，但 RDS 可以通过并不需要灭活小儿原薄膜或通过阻扰小儿原侵入或受阻小儿原侵入后的一时期间隔时间表来阻扰小儿原染小儿。在其他几种传统意义之中医之中也发掘成了防 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活持续性。例如，一种常只见的传统意义之中医——冬瓜。
冬瓜根之中已显然成份冬瓜乙酸以次，可选择持续性 SARS 小儿原[32] 药理学分离株的遗传物质。此外，另一种可用做外科手忍术颤动道疟疾的之中医——双黄连药剂，已说明了成在灌注以副作用选择持续性方固定式选择持续性 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 活持续性。粉条儿菜磷乙酸和粉条儿菜以次拟作为双黄连受阻 3CLpro[33] 的必要成份。
布 5 RDS 选择持续性 SARS-CoV 假型小儿原对 A549(ACE2) 细胞膜的染小儿。用紧接著溶解的 RDS 预两处置 A、B 细胞膜，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型小儿原染小儿。将细胞膜清彩衣，替换成小儿原和 RDS，在不共存 RDS 的确实会下同步进行培育。在染小儿后 48 全程和 72 全程，通过流固定式细胞膜忍术或荧光以次酶验证来管理系统持续性小儿原染小儿的糖皮质激以次。科学研究移位三次。以次描副作用响应曲率，并以次描 RDS 的 IC50 绝对值为 1:70.9 溶解度 (C)
布 6 RDS 选择持续性甲流小儿原对 MDCK 细胞膜的染小儿。(A) 用紧接著溶解的 RDS 预两处置 MDCK 细胞膜 30 分钟，然后用甲流小儿原 (GFP) 对其同步进行染小儿。染小儿后，在 RDS 共存下培育细胞膜。36 全程后用流固定式细胞膜容对小儿原染小儿的糖皮质激以次同步进行管理系统持续性。把未染小儿的细胞膜与被甲流小儿原 (GFP) 染小儿但未获 RDS 两处置的细胞膜同步进行对比。布之中说明了了 GFP+细胞膜的百分比。PI 回应碲丙啶 PI。
(B) 另外还用做了 MTT 定量法管理系统持续性了 RDS 对 MDCK 细胞膜的致癌，以次描了细胞膜致癌的副作用-中间体曲率，经算成，RDS 的九成被害乙酸度为 1:18.5 溶解度 RDS 的必要防小儿原成份即已明确。然而，RDS 相同于粉条儿菜磷乙酸和粉条儿菜以次，RDS 可以通过并不需要灭活小儿原原子核来受阻小儿原染小儿 (布 4)，而粉条儿菜磷乙酸和粉条儿菜以次则在小儿原生命期的后半期通过受阻小儿原酶酶的活持续性来与此相反。然而，RDS 的灌注防 SARS-CoV-2 活持续性仍需在今后的动物科学研究和人类的测试中之中赢取断定。目前为止，我们即将同步进行小型动物科学研究，以明确 RDS 在体内受阻 SARS-CoV-2 小儿原染小儿的实用价值。
▋论点
我们的科学研究表明，RDS 可广为选择持续性颤动道小儿原的染小儿，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型猪流感。
▋分析方法
细胞膜和细胞膜培育
HEK293T (ATCC 巴里格鲁，特拉华州) MDCK (ATCC 巴里格鲁，特拉华州)，VeroE6 (ATCC 巴里格鲁，特拉华州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠予，巴里格鲁，特拉华州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠予，巴里格鲁，特拉华州) 目前为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 成份 10% 微灭活 FBS 和 1×青霉以次-链霉以次 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞膜酿酒酵母之中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的乙酸度转到嘌呤霉以次和潮霉以次 B。
线粒体转染和小儿原提纯
则有 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的太快持续性假型小儿原薄膜由 Virongy LLC (Manassas，VA) 给予，或按照在后描绘的分析方法[15] 提纯。简言之，为了提纯 GFP 路透社基因太快持续性假小儿原，HEK293T 细胞膜与强调 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的表现形固定式、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产成荧光以次酶路透社基因太快持续性假型小儿原，将 HEK293T 细胞膜与强调 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的表现形固定式、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 同步进行共转染。转染后 48 全程搜集小儿原上清液，离心浓缩，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 小儿原 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 给予。pHW-NAGFP (ΔAT6) 分析报告基因线粒体和 A/WSN/1933 H1N1 独有线粒体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi Dr针锋相对给予。在亚型 A-GFP 路透社基因原子核提纯之中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞膜 (ΔAT6)。48 全程后搜集小儿原上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 强调表现形固定式仿造 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 表现形固定式和 S 酶突变表现形固定式。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶突变原子核按照在后描绘分析方法[31] 同步进行提纯。
小儿原染小儿和制剂选择持续性试验中
RDS(欲求肺毒抗生素液)(来自 Dejia Harmony 赠予，利斯堡，特拉华州) 是由牛Dr科学研究室 (Burnaby，BC，Canada) 采购的一种赢利电子产品。RDS 之中所有之中药材成份除此以外符合《之欧美药典 2015 年版》「饮片」标准，包则有必要成份则有量及重金旧称、DDT特别版验证。RDS 是一种之中医的共熬剂，就此产物在气态前提条件下融化。SARS-CoV-2 防血清由 LanceA. Liotta 眼科医生给予。将的兄弟朵尔盐乙酸盐 (Sigma) 原先碎屑在二吡啶亚砜 (Sigma) 之中。对于假型小儿原染小儿，12 孔板之中的 A549(ACE2) 细胞膜 (来自 Virongy LLC 赠予，巴里格鲁，特拉华州) 或 VeroE6 细胞膜用 RDS 预两处置 30 分钟，在 37℃ 下染小儿 4-6 全程，然后在新鲜酿酒酵母之中彩衣涤培育 48-72 全程。对于 VeroE6 细胞膜的染小儿，细胞膜也被 CoV-2 假型小儿原染小儿加强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠予，巴里格鲁，特拉华州) 预两处置后，在 37°C 下再行两处置 30 分钟。用做 GloMaxDiscover 酶标容 (Promega) 分析分析方法细胞膜裂解物的荧光以次酶活持续性。对于野生型 SARS-CoV-2 染小儿，VeroE6 细胞膜在 37°C 下用 RDS 预两处置 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 染小儿 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在弗雷德里克安德森私立大学的 BSL-3 收容设施内停留 1 全程。细胞膜用 PBS 彩衣涤 2 次，用则有 RDS 的酿酒酵母培育 48 全程。从上清之中浓缩小儿原，用 12 孔板培育的 Vero 细胞膜单层之中的凶菌斑试验中定量小瓶滴度。简言之，每个试样在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 酿酒酵母 (VWR) 之中提纯，包则有 1X 青霉以次-链霉以次 (VWR)，并附加 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种溶解液种会附到 VeroE6 细胞膜单层的三个平行孔上 1 全程。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一大部分完整的 Eagle Minimal Essential 酿酒酵母 (VWR) 的硫乙酸布满单层，则有 1X 青霉以次-链霉以次，并附加 10%FBS。48 全程后，将单层膜一般而言在 10% 甲醛氯化钠之中 1 全程，并去除布满的琼脂里斯。为了染料斑点，转到成份 20% 乙醚的 1% 固体虎皮染料氯化钠 5 分钟，然后用去离子水彩衣涤。对于乙型亚型染小儿 MDCK 细胞膜，在 37°C 下用 RDS 预两处置 30 分钟，然后用 A-GFP 路透社基因小儿原染小儿 6 全程。用则有 RDS 的酿酒酵母彩衣涤细胞膜，培育 36 全程。GFP 强调通过流固定式细胞膜容管理系统持续性。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 小儿原薄膜的 RDS 灭活试验中，将 100μl 紧接著溶解的 RDS 附加到 1 mlSARS-CoV-2 小儿原原液 (3.65×105PFU/ml) 之中，就此 RDS 溶解为 1:20，1:40 或 1:80。也包则有对照前提条件 (1 ml 小儿原+100μl 酿酒酵母)。硫乙酸在 37°C 下培育 1 全程。随后，对硫乙酸同步进行新作溶解以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 溶解度，并将紧接著溶解的试样转到 12 孔板之中的 Vero 细胞膜之中，用做同步进行凶菌斑定量分析分析方法。斑点定量之中就此的 RDS 溶解度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 溶解液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶突变原子核按照在后描绘的分析方法[31] 提纯。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 紧接著溶解的 RDS 附加到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或则有之中，就此 RDS 溶解度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将硫乙酸在 37°C 下培育 1 全程，然后在 RDS 共存下染小儿 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞膜 12 全程。用做 GloMax Discover 酶标容 (Promega) 分析分析方法细胞膜裂解物的荧光以次酶活持续性。
细胞膜致癌分析分析方法验证
用碲丙啶染料和流固定式细胞膜忍术计量对 A549 (ACE2) 细胞膜和 VeroE6 细胞膜的制剂细胞膜致癌同步进行验证，如述及 (34)。用做细胞膜续殖羰基盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的方案对 MDCK 细胞膜的制剂致癌同步进行计量。简言之，将 MDCK 细胞膜 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞膜的运动速度接种到 12 孔板之中。细胞膜培育隔夜后，通过 RDS 两处置 1 天，然后在 MTT 标上羰基 (Sigma) 的酿酒酵母之中培育。将细胞膜与标上羰基共同培育 4 全程，再行近期转到 MTT 续氯化钠。培育皿幼鸟过夜，用 GloMax Discover 酶标容 (Promega) 定量种会表面温度。
略称
SARS-CoV：严重急持续性颤动管理系统症候群涉及冠状小儿原；SARSCoV-2：Severe 严重急持续性颤动管理系统症候群涉及冠状小儿原-2；TCM：传统意义之中医；RDS：颤动道排毒抗生素液；Ha-CoV-2：混合成乙型新冠小儿原假小儿原。
致谢
来向 FengLi 给予亚型强调表现形固定式，来向 LanceLiotta 给予防毒血清；来向 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的探讨与建议；来向 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 给予 RDS 和药材人类碱。
笔记贡献
此次科学研究由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 主编。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该科学研究。所有笔记已阅读并批准就此审阅。
资金
本科学研究的费用来自于弗雷德里克安德森私立大学之下拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 给予。
数据和涂料的复杂持续性
本科学研究之中产生或分析分析方法的所有数据除此以外包则有在本文之中。羰基可从 Y.W 两处给予。
声明
批准及投身于首肯
不符合
首肯编辑成版
不符合
竞争利益集团
弗雷德里克安德森私立大学国家所人类部署和传染小儿之的中心的 RMH 和 YW 已授予了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的科学研究资助，LAH 为德佳和畅被选为助理并授予了酬金。不会其他关联或活动确实会影响到提交的指导工作。
笔记清单
1宾夕法尼亚州特拉华州弗雷德里克安德森私立大学管理分子人类学学院国家所人类部署和传染小儿之的中心，巴里格鲁 20110。
2VirongyLLC，特拉华州巴里格鲁。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 牛Dr科学研究室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 宾夕法尼亚州特拉华州利斯堡筹备会议科学组织，20176。
收稿月份：2021 年 4 同年 7 日
放弃月份：2021 年 5 同年 10 日
线上编辑成版间隔时间：2021 年 5 同年 29 日
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主编： 翟微男相关新闻
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